很多細胞實(shí)驗都要檢測熒光，為方便大家選擇合適的方法，在此簡(jiǎn)單說(shuō)一下各種熒光檢測方法的特點(diǎn)。不足的地方，歡迎大家補充：

1、流式，優(yōu)點(diǎn)是速度快，非常適合做大數量統計，且樣品只被檢測一次，*不用擔心熒光淬滅的問(wèn)題。缺點(diǎn)是只能檢測熒光的有無(wú)、強度大小，無(wú)法提供空間定位信息，無(wú)法做熒光定位變化的實(shí)驗；由于樣品只被檢測一次，因此無(wú)法對同一個(gè)樣品進(jìn)行連續觀(guān)察。例如，做膜蛋白定位時(shí)會(huì )得到這么一個(gè)結果——用流式可以檢測出信號，但是用顯微鏡卻看不到東西，排除儀器和濾光片選擇問(wèn)題，很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標記造成流式的假陽(yáng)性結果。

2、熒光顯微鏡，剛好與流式互補，可很好地進(jìn)行空間觀(guān)察，判斷目標蛋白的定位，但是不適合做大流量檢測，估計沒(méi)人能經(jīng)得起時(shí)間的考驗。有不同倍率的物鏡選擇，可以使用高倍物鏡看精細結構，或用小倍率物鏡做少量統計。與之搭配的CCD和軟件，是系統能否發(fā)揮性能的關(guān)鍵。尤其是CCD，從那么多商品里選一款合適的不容易，需要了解很多知識否則只能聽(tīng)別人忽悠。

3、共聚焦，熒光顯微鏡的升級產(chǎn)品，具有很好的光學(xué)層切效果，能得到很好三維定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照，取得一張好看的圖片，就讓人覺(jué)得可惜了。共聚焦基本都是全自動(dòng)系統，可隨意定義照明區域、選擇多個(gè)熒光通路和設定定時(shí)取圖，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其獨到的優(yōu)勢。另外，4Pi和STED又是其中的極，具有超高的空間分辨率，只是使用不方便，未必適合做生物實(shí)驗。

4、全內反射，熒光顯微鏡的另一種升級產(chǎn)品，屬于近場(chǎng)光學(xué)范疇，只適合且合做膜研究，無(wú)法看到胞內信息。也是用CCD成像，但是對CCD的要求更高——個(gè)人甚至覺(jué)得對CCD的要求是沒(méi)有上限的。

5、雙光子，另一種共聚焦，因使用長(cháng)波激發(fā)熒光，故能做深層檢測（突破共聚焦的100微米極限），典型的應用是觀(guān)察活體腦組織。巨貴無(wú)比，國內沒(méi)有幾臺，能用上的人不多——就不說(shuō)了。

6、新推出的高內涵藥篩系統，流式和顯微鏡的雜合體，使用電動(dòng)載物臺，可以自動(dòng)地按預定程序完成實(shí)驗，可做大流量檢測（雖然速度慢點(diǎn)），而且有成像能力，可以判斷定位。前段時(shí)間，國內哪裝了一臺，很多人在吹，但我實(shí)在不知道其中的好處——任何一臺帶電動(dòng)載物臺的顯微鏡都可以達到相似的效果，只要軟件支持——估計有人賺大發(fā)啦！

從以上的簡(jiǎn)介可以看出，只要是熒光樣品，就應該都可使用以上儀器檢測（只用TIRF受一些限制）。但是實(shí)際應用時(shí)，大家可能會(huì )碰到某些樣品可以使用流式和顯微鏡，但是無(wú)法使用共聚焦。為什么？解釋一下：

首先，熒光檢測必須有激發(fā)光照明，染料被特定波長(cháng)的光照射以后才能發(fā)射熒光。激發(fā)光源有兩種：1）白光（汞燈、氙燈等），然后通過(guò)濾光片選擇只通過(guò)特定波長(cháng)的光。如檢測GFP時(shí)，大家能看到藍光照射在樣品上，因為GFP的激發(fā)條件是488nm 光。但是有一點(diǎn)，顯微鏡不可能裝無(wú)限多的濾光片，所以選擇是有限的。2）激光，普通的激光器只能發(fā)射特定波長(cháng)的光，且數量有限，常見(jiàn)的是405、488、514、543、633等，所以可使用的染料也是有限。因此，大家判定儀器能否滿(mǎn)足你實(shí)驗要求，務(wù)必先看看激發(fā)條件是否合適。

其次，在光檢測器（PMT、CCD)前還有一塊濾光片，作用是反射樣品各種散射光，只通過(guò)特定波長(cháng)的熒光，提高信噪比，得到干凈的背景。因此，這塊濾光片也決定了儀器能否滿(mǎn)足你的實(shí)驗要求（不用太擔心，這個(gè)一般和激發(fā)濾光片配套，不會(huì )有太多問(wèn)題）。而在光譜型共聚焦里，使用的是棱鏡或衍射光柵分光，可以選擇通過(guò)任意需要的波段。這對使用量子點(diǎn)做標記的同學(xué)特別有好處！